【科普】基础的细胞实验

2021-10-28 12:28:54 管理员 328

1.体外培养细胞一代生存期

Ø  分为游离期、贴壁期、潜伏期、对数生长期、停止期(平台期)。

Ø  对数生长期:细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳,细胞数量呈指数增长,细胞群体均一。最适合进行实验研究。

Ø  细胞摇匀的经验:

孔越小,越要好好摇。种的时候可以有意识的分散种细胞,而不是直接一个小区域种下去。96孔板种细胞轻点打进孔里,打的太猛细胞容易聚集在边缘。六孔板手动8字晃匀效果比较好。种细胞时晃动细胞很重要,但应避免在桌子上推着前后左右晃。在手中两个方向的八字晃会更稳更好。


2. 细胞计数

道赛尔


Ø  细胞悬液的细胞数/ml=(四个大格子细胞数/4)  ×稀释倍数 ×104/ml

Ø  计数建议:

1)         压边线细胞:计上不计下,计左不计右;

2)         镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液;

3)         每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。

Ø  提问:细胞计数的浓度控制在多少?计数重复几次?

答:建议浓度控制在50-100/ml。建议表型实验计数4次,普通实验计数2次。建议全部计数完再一起种板。

Ø  注意点:细胞计数不要同时记超过4株以上的细胞。若有需要,先消化记4株,细胞浓度调好静置一边;再消化计另外的。而后按消化和计数顺序种细胞。这样可以避免多株细胞同时消化而带来的消化不理想。


3. 常用细胞培养器皿

道赛尔


4. 液氮是低温制品,在使用过程中要防止冻伤。在液氮中操作及存取冷冻物品时速度要快,要注意轻拿轻放,以免内容物解冻,造成不必要的损失。


5. 细胞传代

Ø  消化温度:室温或37℃。

Ø  消化时间:不超过10 min,也不可太短(须形成单细胞悬液)。

Ø  注意点:

1)         防止细胞成片滑落(4℃消化,延长消化时间较易获得单细胞悬液);

2)         轻柔吹打,防止机械损伤;

3)         离心时不超过300 g 1000 rpm),实验室目前离心所用转速为800rpm

4)         尽量避免刮伤培养瓶细胞贴附面,否则影响观察且细胞贴壁不均匀;

5)         及时换液和传代,不可拖延,避免细胞过爆后细胞状态不好。


6. 细胞消化条件参考

Cell line

胰酶

条件

时间

传代比例

长满时间

10cm dish细胞数

Huh1

EPET

37

4 min

14

5d

400w

Huh7

EPET

37

2 min

1:6

4d

200w

HLE

EPET

37

3 min

1:8

3d

200w

HLF

EPET

37

3 min

1:8

3d

200w

HepG2

0.25%Trypsin

37

4 min

1:3

5d

200w

Hep3B

0.25%Trypsin

37

1.5 min

1:4

4d

-

HUCCT1

0.25%Trypsin

37

6 min

1:10

3d

500w

RBE

EPET

37

2 min

1:10

3d

200-300w

Huh28

0.25%Trypsin

37

6 min

1:3

3d

30w

293T

1/10 EPET

RT

1 min

1:20

3d

1000w

3T3

EPET

37

3 min

1:8

3d

400w

LX2

EPET

RT

1 min

1:3-1:4

2-3d

-

THP1

-

-

-

1:4

3

-

7. 换液时机

1)         pH降低。培养基颜色由红变橙要警惕,变成黄色前一定要换液。

pH降至6.5时,细胞停止生长。

pH降至6.0时,细胞失去活性。

2)         发现细胞出现形态衰退时须勤换液。

3)         细胞密度过低或生长缓慢,则更换一半培养基。


8. 细胞冻存(慢冻)

Ø  预先配制冻存液:10DMSO +细胞生长液(50%血清+40%基础培养液)。

由于DMSO 稀释时会放出大量热能,故不可将DMSO直接加入细胞液中,必须使用前先行配制完成。

Ø  取对数生长期细胞,经胰酶消化后,加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液(1-5×106 cell/ml)

Ø  1 ml细胞悬液于冻存管中,密封后标记冷冻细胞名称、冷冻日期、代数、细胞数量和实验者名字。液氮长期保存。

Ø  慢冻程序:

1)         标准程序:采用细胞冻存器。

当温度在-25℃以上时, 12 /min

当温度达-25℃以下时, 510 /min

当温度达-100℃时,可迅速放入液氮中

2)         传统程序:冷冻管置于4 1 h→ -20 1 h→ -8016-18 h(或隔夜) → 液氮槽长期储存。


9. 细胞的复苏方法(速融)

Ø  注意点:37℃水浴,快速解冻,避免慢速融化水分渗入细胞内,再次形成胞内结晶损伤细胞。

Ø  冻存细胞从液氮中取出后,立即放入37℃水浴中,轻轻摇动冷冻管,使其在1 min内(不要超过3 min)全部融化,5 min内用培养液稀释至原体积的10倍以上。

Ø  两种解冻后处理方法:

1)         解冻后的细胞直接接种到含完全生长培养液的细胞培养皿进行培养,24 h后更换培养液,以去除DMSO

2)         解冻后的细胞先通过低速离心10 min去除冷冻保护剂,然后再接种到含完全生长培养液的培养皿中。


10. 荧光显微镜启动高压汞灯后,不得在30 min内将其关闭;关闭后,必须待汞灯冷却后方可再次打开。


11. Lentivirus production in 293T cells

Using Lipofectamine 3000, Ji lab, 2019

1.      The day before transfection (Day 1), passage1/3 10 cm dish 293T cells in a new 10cm dish so that they will be 70-80% confluent on the day of transfection.

2.      On the day of transfection (Day 2), remove the culture medium from the 293T cells and replace with 6 ml of fresh medium (without antibiotics) containing serum.

3.      For each transfection sample, prepare DNA-Lipoectamine™ 3000 complexes as follows:

l  In a sterile 1.5 ml tube with 0.5ml Opti-MEM®, add:

Packaging Plasmid--psPAX2      (10703bp, addgene12260)   5.3ug

Envelope Plasmid---pMD2.G      (5824bp, addgene12259)    1.4ug

or

Packaging Plasmid--pCMV-dR8.2 dvpr (13457bp, addgene8455)  6.6ug

Envelope Plasmid---pCMV-VSV-G    (6363bp, addgene8454)   1.6ug

AND

Transfer Plasmid---Lenti-miR/miRZip-antimiR (SBI, 7.5/7.9kb)  5.3ug

Note:The proper molar ratio shall be Envelope PlasmidPackaging PlasmidTransfer Plasmid=1:2:3~4.

l  Adding p3000. p3000 (volume): plasmid (ug) =2:1

l  Mix gently, RT for 5 mins.

4.      In a separate sterile 1.5 ml tube with 0.5ml Opti-MEM®, add: Lipofectamine™ 3000 20ul.

Mix gently, RT for 3-5 mins  (Note: has to be less than 15mins)

5.      After the incubation, combine the above diluted DNA with the diluted Lipofectamine™ 3000.

Mix gently. Incubate, RT for 20 minutes.

6.      Add the DNA-Lipofectamine™3000 complexes to each dish of cells. Mix gently by rocking the plate back and forth.

7.      After 24 hours post transfection (Day 3), add 8 ml fresh medium (without antibiotics) containing serum. Incubate at 37°C in a humidified 5% CO2 incubator.

8.      Harvest virus-containing supernatants 52hours posttransfection (Day 4) by removing medium into to a 15 ml sterile tube, keep on ice.

9.      Centrifuge supernatants at 2000 rpm for 10 minutes at +4°C to pellet debris.

10.  Filter the viral supernatants through a 0.45 µm filter.

11.  Aliquot viral supernatants into 1.5 ml tubes (0.5ml/tube). Store viral stocks at -80°C.

12.  Proceed to Titer Your Viral Stock.

Note: If use lipo 2000, no need add p3000. If use PEI 40,000, PEI: plasmid=1.875: 1


12. Titer LentiVirus

Viacounting GFPcells, Ji lab, 2016

1.      The day before transduction (Day 1), trypsinize and count the 3T3 cells, plating 3000 cells/well of 96-well plate. Incubate cells at 37°C overnight in a humidified 5% CO2 incubator.

2.      On the day of transduction (Day 2), thaw your Lentiviral stock and prepare 10-fold serial dilutions ranging from 10-1 to 10-8. For each dilution, dilute the Lentiviral stock into complete culture medium to a final volume of 0.15 ml. DO NOT vortex, But mix well.

l  Using 96-well plate to do the dilution and tittering.


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

D

D

D

D

D

D

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

B

D

D

D

D

D

D

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

C

D

D

D

D

D

D

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

D

D

D

D

D

D

D

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

E

D

D

D

D

D

D

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

F

D

D

D

D

D

D

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

G

D

D

D

D

D

D

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

H

D

D

D

D

D

D

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

3T3

l  Column #1-#6 is used for dilution.

l  Add 135 ul of culture medium to each dilution well.

l  Line A: add 15 ul virus from original lentivirus stock. Mix well

l  Line B: add 15 ul virus from the well of line A. Mix well

l  Line C: add 15 ul virus from the well of line B. Mix well

l  ……

l  So, line A is 10× dilution; line B is 100× dilution.

3.      Remove the culture medium from the cells. Mix each dilution gently by pipetting and add 0.1 ml to one well of cells (total volume = 0.1 ml).

4.      Add Polybrene® to each well to a final concentration of 8 µg/ml.

5.      Swirl the plate gently to mix. Incubate at 37°C overnight in a humidified 5% CO2 incubator.

6.      The following day (Day 3), remove the media containing virus and replace with 0.1 ml of complete culture medium. Incubate at 37°C overnight in a humidified 5% CO2 incubator.

7.      Incubate cells for an additional 3 days. Analyze the percentage of GFP-positive cells.

8.      Calculate the titer (TU/ml) by with the formula:

Titer = # of positive clones / 0.1ml × times of dilution


13. 腺相关病毒(Adeno-Associated Viral VectorAAV

腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus),为无包膜的单链线状 DNA 病毒。AAV 的基因组约4700bp,包括上下游两个开放读码框架(ORF),位于分别由 145 个核苷酸组成的2 个反向末端重复序列(ITR)之间。

基因组中有 3 个启动子(P5P19 P40) 2 个开放阅读读框(ORF)rep cap,如图所示。rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白,即 Rep78Rep68Rep52 Rep40,其中 Rep78 Rep68 参与 AAV 的复制与整合,Rep52 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性,与 Rep78Rep68 共同参与单链基因组的复制;cap 编码的 VP1 VP2VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白,它们在 AAV 病毒整合、复制和装配中其重要作用。

道赛尔

From腺相关病毒操作手册


14. 重组腺相关病毒载体系统简介

AAV是一种复制缺陷型微小病毒,其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。

AAV无辅助病毒系统(AAV Helper-Free System),可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。生产具有感染性的AAV 病毒颗粒所需的腺病毒基因产物(如:E2AE4 等基因)大部分由pHelper 质粒提供。

腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。AAV-293细胞是HEK293细胞经过改良腺相关病毒生产能力而衍生出的亚克隆细胞系。

repcap基因从病毒载体中被转移到辅助质粒pAAV-RC 中,AAV ITRs 仍位于病毒载体中。在辅助质粒的帮助下,仅需两端的ITR就能将携带的外源片段包装进入腺相关病毒颗粒。

道赛尔

Ø  AAV可以特异地只感染肝脏或者其他器官,不同血清型AAV对不同组织亲和度不同,如AAV8对肝脏组织亲和度最高。

Ø  AAV不整合在基因组上,降解较慢,大约能在体内保持6个月以上,一般不需要重复给AAV,根据实验具体考虑。

Ø  AAV最长可插入片段参考:

道赛尔


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