如何做好细胞克隆形成

2021-08-10 10:00:10 道赛尔生物 604

(一)实验目的

通过细胞在细胞培养板上的克隆形成能力来提示细胞的增殖能力。


(二)实验原理

克隆形成是测定细胞增殖能力的有效方法之一。单个细胞在体外持续6代以上,其后代所组成的细胞群称为克隆。这时每个克隆含有50个以上的细胞,大小在0.3-1.0 mm之间,通过计数克隆形成率,可对单个细胞的增殖潜力做定量分析,了解细胞的增殖能力和独立生存能力。


(三)实验流程

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(四) 实验材料

生物安全柜、荧光显微镜、离心机、倒置显微镜、CO2培养箱;

完全培养基、胰酶、PBS、结晶紫、4%多聚甲醛。


(五)实验步骤

1.  准备感染后细胞[如果是克隆形成预实验,直接用空细胞进行实验] :将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化,完全培养基重悬,制成细胞悬液,计数。


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吸弃培养基


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PBS清洗


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加入胰酶


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终止消化


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收集细胞


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离心获取沉淀


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细胞计数


2.  细胞接种:于6孔板培养板中各实验组接种500-1000个细胞/孔[正常增殖速度为1:5-1:10传代,3天长满细胞,可以接种500个细胞,其余增殖缓慢细胞,可以接种800-1000;接种时注意梯度稀释细胞悬液,观察细胞密度,以免因计数不准确导致实验结果偏差] ,每个实验组设3个复孔,培养基为含30%FBS的完全培养基;

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铺板

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铺板后摇匀


3.  将接种好的细胞摇匀后轻放于培养箱中继续培养,每隔3 天进行换液并观察细胞状态,显微镜下观察克隆大小[3复孔之间克隆大小应相似] ,待单个克隆生长到大小不超过图片视野时可以进行拍照;


4.  拍完照之后的将6孔板放入培养箱中继续培养,待孔中大多数单个克隆中细胞数大于50为止,弃上清,PBS洗涤细胞1次。


5.  每孔加入1 mL 4%多聚甲醛[有毒,注意在安全柜中操作] ,4度冰箱固定细胞60 min,PBS洗涤细胞1次。


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加入多聚甲醛


6.  每孔加入洁净、无杂质结晶紫染液1000 μL,染细胞2min。

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7. ddH2O洗涤细胞数次,晾干,数码相机拍照整,克隆计数。


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吸弃染液


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加入超纯水清洗


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晾干


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拍摄


(六) 吉凯结果

1. 数码照相机拍摄结果

2. 荧光显微镜拍摄代表性克隆结果


(七) 实验操作参考文献

[1] Ruan J. et al. Increased expression of cathepsin L: a novel independent prognostic marker of worse outcome in hepatocellular carcinoma patients. PLoS One. 2014, 9(11):112-136.

[2] Sun R. et al. Down regulation of Thrombospondin2 predicts poor prognosis in patients with gastric cancer. Mol Cancer. 2014, 13:225.

[3] Ma Y. et al. Prostate cancer cell lines under hypoxia exhibit greater stem-like properties. PLoS One. 2011, 6(12):e29170.

[4] Suresh B. et al. Stability and function of mammalian lethal giant larvae-1 oncoprotein are regulated by the scaffolding protein RanBPM. J Biol Chem. 2010, 285(46):35340-9.

[5] Liu JW. et al. ssDNA-binding protein 2 is frequently hypermethylated and suppresses cell growth in human prostate cancer. Clin Cancer Res. 2008, 14(12):3754-60.


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