【科普】真传的一些细胞周期实验要点

2022-03-04 08:47:31 管理员 336

核心:最关键的就是减少细胞碎片和单细胞悬液的制备!


1、原理:细胞在有丝分裂的过程中DNA会复制扩增加倍,为原来的1-2倍。PI染色DNA后,通过检测DNA的量来判断细胞周期状态。G1期细胞主要进行RNA和蛋白的合成,DNA数目为n。S期DNA开始复制,直到复制结束进入M期,DNA数目为n-2n。G2期主要是RNA和蛋白的合成,为M期做准备DNA数目为2n。M期细胞分裂的过程,直到M结束细胞一分为二,DNA数目也是2n。从DNA的数目上,我们可以将细胞周期分为G0/G1期,S期,G2/M期.

道赛尔


2、细胞消化要理想,资料显示最好消化时加EDTA,充分使细胞消化成单个细胞,因为细胞成团会被流式细胞仪误检测成多倍体,从而使结果中G2/M期细胞比例增加。


3.细胞消化后不可吹打过度,减少细胞破碎;以后的吹打也要注意,尤其是固定后的细胞容易破碎。


3、细胞用PBS洗涤离心,转速不超过1000r/min,有文献用800r/min;可考虑在此过程中用300目的尼龙网过滤一遍细胞(有人主张用钢网,以 减少细胞与尼龙网粘连的损失,本人觉得钢网易损伤细胞,DNA外溢也会造成细胞粘连,所以在细胞数足够的情况下,首选尼龙网)。


4、离心后的固定,标准做法是将细胞悬液加入预冷70%酒精,而不是向细胞中加酒精,这样是为了减少细胞聚集,这一点很重要,很多人都忽视了!


5、一般选择4℃固定过夜,固定时间不要超过24小时。


6、加染液前的洗涤仍要注意离心转速的问题。


7、关于PI染液的组成及配方,应主要以文献为主,PI(作用为DNA染色剂)的浓度从0.5μg/ml,20μg/ml,到50μg/ml都见报道。RNAs酶(由于PI也可染RNA,用RNA酶降解RNA,从而PI染色能精准的反应DNA的含量。)一般浓度为50μg/ml,配方中的Triton-X-100(曲拉通)主要是通透细胞膜使PI能进入细胞核。


8、检测时细胞要达到1~2×10^6个细胞(实际检测是1-5万个细胞左右),为了既保持初始条件相同,又可收集到足够的细胞,应选用多孔培养板,在收集细胞时,浓度大、抑制强的组可多收集些孔,以保证检测的细胞数量。如果细胞数量太低,技师就会选择高速流(一般的检测用低速流,误差小),检测的质量就会大大下降,数据的说服力就下降了!


道赛尔


9、周期结果图中各相峰高耸,各期分开清楚显示较好的结果。



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