【科普】小鼠调节性T细胞鉴定方案

2022-03-25 09:08:40 道赛尔生物 619

小鼠调节性t细胞(Treg)鉴定步骤

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配色方案

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小鼠Treg鉴定所需流式抗体

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小鼠Treg鉴定所需辅助试剂

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样本管设置

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实验步骤

一、小鼠脾细胞分离步骤:

1.取小鼠脾脏,置于PBS中;

2.可用注射器柱塞研磨脾脏,并通过70μm细胞过滤器过滤,收集滤液到15mL离心管;

3.300g离心5min,弃上清,得到红色细胞沉淀;

4.加2mL 1x红细胞裂解液,重悬沉淀,室温下裂解2~3min,再加10mL PBS,终止裂解反应;

5.300g离心5min,弃上清,得到白色细胞沉淀,用细胞染色缓冲液重悬细胞,并做细胞计数,调整细胞浓度为1×107/mL。


二、细胞固定破膜实验步骤:

(下面是全染管的实验步骤,空白组不加抗体,单染管只在对应步骤加对应流式抗体,同型对照组将相应的流式抗体替换成同型对照,所有组都要固定破膜)

1.根据检测的量,稀释Foxp3检测专用的固定剂和破膜剂;

2.取100μL小鼠脾脏细胞(1×106个细胞),置于流式管内,加入1Test的FITC Anti-Mouse CD4(E-AB-F1097C)和1Test的APC Anti-Mouse CD25(E-AB-F1102E)混匀,4℃孵育30min;

3.孵育完毕后,加入1mL细胞染色缓冲液,300g离心5min,弃上清,再加入100μL细胞染色缓冲液,重悬细胞;

4.加入1mL固定剂,涡旋混匀,4℃反应30min;反应完成后,600g离心5min,弃上清;

5.加入2mL破膜剂,涡旋混匀,600g离心5min,弃上清;

6.重复步骤5;

7.加入100μL破膜剂,重悬细胞,再加入PE Anti-Mouse Foxp3(E-AB-F1238D),混匀后室温孵育30min;

8.加入2mL破膜剂,600g离心5min,弃上清;

9.加入200μL细胞染色缓冲液,重悬细胞,即可上机检测。


解析:

▶ 圈门路径:

首先,根据FSC-A和SSC-A圈中目的细胞;

其次,利用光散射特性,去黏连,得到单细胞;

再次,通过CD4,确定CD4+辅助T细胞;

最后,通过CD25+/Foxp3+,确定出Treg细胞亚群。

任何有关“流式实验”或“Treg研究”的疑问,可以给我们留言,我们将为大家详细解答哦~



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